在反相 HPLC 中，如果成功分離的條件未知，建議運行搜索梯度。 這種運行是在 30-50 分鐘內(nèi)從 10% 到 80% 的有機(jī)改性劑進(jìn)行的，使用洗脫強(qiáng)度的線性增加。 根據(jù)此篩選梯度的結(jié)果，可以選擇合適的流動相組成進(jìn)行等度洗脫，或者必須遵循合適的梯度。

可以選擇梯度洗脫來分離極性差異很大的化合物。 根據(jù)經(jīng)驗，如果在超過 25% 的篩選梯度期間可以檢測到峰，則梯度洗脫可能是該分離的zui佳選擇。 如果峰出現(xiàn)的時間小于搜索梯度的 25%，則應(yīng)首 選等度洗脫，因為在等度條件下選擇性始終較高。

如果樣品由兩組不同的化合物組成，分步洗脫可以獲得良好的分離結(jié)果。 在這種情況下，首先采用等度流動相洗脫，這樣可以為較少保留的一組化合物提供令人滿意的分離結(jié)果，然后在一個步驟中將流動相的洗脫強(qiáng)度增加到這樣一個程度，即可以將保留較多的一組化合物分離出來。一種適當(dāng)?shù)姆绞健? 階梯梯度也可用于在每次進(jìn)樣后清洗色譜柱。 在這種情況下，洗脫強(qiáng)度在zui后一個峰洗脫后急劇增加。 然后可以從色譜柱中去除強(qiáng)保留的雜質(zhì)。