[色譜柱的使用]實驗結(jié)果不重現(xiàn)該怎么辦？
在日常檢測或方法轉(zhuǎn)移過程中，新色譜柱無法重現(xiàn)舊柱的方法，或者不同時間測試結(jié)果不重現(xiàn)，是困擾分析人員的常見問題之一，具體是什么原因?qū)е碌哪兀?/span>可以從哪些方面進行排查？
本文將結(jié)合兩個實際案例為大家說明。
客戶開發(fā)的分析方法，轉(zhuǎn)移到新site后發(fā)現(xiàn)新購買的同一批次3根CORTECS C18新柱都無法重現(xiàn)原方法，但僅第1個化合物峰形較差，其他峰均無問題，這可能是什么原因？見圖一。色譜柱返回沃特世實驗室后，首先復(fù)核色譜柱柱效，3條色譜柱性能均正常，判斷化合物峰形不佳不是色譜柱的質(zhì)量問題。然后按照客戶提供的方法重現(xiàn)樣品分析條件，發(fā)現(xiàn)與客戶反饋的結(jié)果一致，峰1拖尾嚴(yán)重。后期我們在原分析方法的基礎(chǔ)上進行了調(diào)整，如增加甲酸濃度，使用50 mM甲酸銨（pH不變）等，發(fā)現(xiàn)使用緩沖鹽后，峰形明顯改善，但出峰順序改變。見圖二。優(yōu)化后的方法（使用50 mM甲酸銨）在不同色譜柱上的重現(xiàn)結(jié)果，見圖三。同一支色譜柱同一個樣品，在pH耐受性試驗中發(fā)現(xiàn)個別雜質(zhì)峰保留時間不穩(wěn)定，隨pH變化而改變，如圖四所示，說明該雜質(zhì)對pH敏感，為何會出現(xiàn)這種現(xiàn)象？我們應(yīng)該如何應(yīng)對？
我們知道酸/堿性化合物的保留行為受pH影響很大，酸性化合物在低pH的條件下呈分子狀態(tài)，保留較好；而堿性化合物在高pH的條件下呈分子狀態(tài)，保留較好。而當(dāng)流動相pH趨于化合物pKa（即非保留平臺區(qū)）時，pH變化會嚴(yán)重影響化合物的保留行為，如圖五所示。在方法開發(fā)初期盡量將流動相pH設(shè)置在分析物pKa±2以外區(qū)域，若無法避開，pH的精準(zhǔn)控制將非常重要，建議盡量采用稱重法配制流動相，以保證不同時期配制流動相測試的可重現(xiàn)性。綜上，當(dāng)分析方法中使用添加劑或者緩沖鹽的濃度較低時，可能容易出現(xiàn)新柱結(jié)果不重現(xiàn)的問題，您可以考慮以下Tips~
? 增加添加劑或者緩沖鹽濃度，或者使用高濃度緩沖鹽老化新色譜柱后再使用。
? 對pH敏感項目如肽藥，需要對pH精準(zhǔn)控制，流動相配制可采用稱重法。
? 方法開發(fā)初期盡量多考察不同批次色譜柱，以驗證方法的耐用性。
注：本文分享自【沃特世技術(shù)服務(wù)】公眾號。
