色譜柱的使用及維護(hù)

轉(zhuǎn)自丁香園

1、使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）。

2、流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。

3、避免流動相組成及極性的劇烈變化。

4、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2～7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。

5、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存乙腈中。

6、壓力升高是需要更換預(yù)柱或沖洗色譜柱的信號。

系統(tǒng)注意事項(xiàng)

1、開、關(guān)系統(tǒng)，流速應(yīng)有緩沖（1ml/min→0.8ml/min→0.4ml/min→0ml/min），以免壓力突變致使柱頭填料塌陷。

2、流動相是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水），沖洗5～10個柱體積以后才更換強(qiáng)溶劑。

3、做完測試后切忌直接用100%有機(jī)溶劑沖洗柱子，須用90%水-10%有機(jī)溶劑（如流動相是緩沖液，應(yīng)用純水或含5%有機(jī)溶劑-水溶液）沖洗至少30min后，用有機(jī)溶劑沖洗30min左右，*后將色譜柱保存在有機(jī)溶劑中。

4、更換色譜柱前，須對使用的色譜柱進(jìn)行沖洗、平衡后，保存在有機(jī)溶劑中（*好是乙腈中）。

5、取下色譜柱時，應(yīng)立即將兩端封口。

6、除特殊情況外，一般都應(yīng)使用預(yù)保護(hù)柱。

平衡色譜柱的原因

反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的，由于色譜柱在儲存或運(yùn)輸過程中可能會干掉，如不進(jìn)行平衡，樣品中含有的一些鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)很容易與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)，使這些物質(zhì)吸附在色譜柱上，使色譜柱污染。

如何平衡色譜柱？

因此在用流動相分析樣品之前，我們應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果我們所使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過渡”。平衡過程中，將流速緩慢地提高用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時間來平衡）。

色譜柱污染后可能出現(xiàn)的情況？

滯留在色譜柱中被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相，有時候這些分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理，這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線擾動及基線漂移等現(xiàn)象，在色譜圖上出現(xiàn)“怪峰”，表現(xiàn)為負(fù)峰、寬峰、饅頭峰、雙頭峰及前吐舌后拖尾峰和保留時間會波動。這些行為通常只有通過平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。

 

色譜柱污染后如何清洗和再生？

當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓問題。被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。

再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コＨ绻廴臼且驗(yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用90～100%的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個體積可以**污染物。例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。

一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常*后一個溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時，必須借助一個中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。沖洗色譜柱時，沖洗液由色譜柱出液端直接接入廢液瓶，不能流經(jīng)檢測池，以**測池被污染。

反相色譜柱沒有使用緩沖溶液，請使用以下溶劑系列再生：

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈-25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%正己烷→100%二氯甲烷→100%異丙醇→100%乙腈。

反相色譜柱使用緩沖溶液，請使用以下溶劑系列再生：

水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水。

表　用來沖洗的溶劑體積、時間

色譜柱尺寸  柱體積  所用溶劑的體積  沖洗時間
　　150-4.6   2.5ml  50ml   50min
　　250-4.6   4.2ml  80ml   80min

每種溶劑至少沖洗20個柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，可以用1ml/min的流速來沖洗，沖洗后使用沒有緩沖的流動相進(jìn)行平衡色譜柱。

注：如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，說明色譜柱嚴(yán)重污染，沖洗溶劑可以用①0.05M稀硫酸，②二甲基亞砜（DMSO），③二甲基甲酰銨-水（50：50），用低于0.5ml/min的流速沖洗非常有效。